胃癌T细胞疗法,T细胞治疗,T细胞免疫疗法临床研究进展
作者：徐睿涵 吴坚 陈敏 邹玺 刘沈林
本文来源：中华肿瘤杂志, 2019,41(5) : 321-325.
肿瘤最终的发展结果取决于机体免疫系统和肿瘤细胞的相互作用。肿瘤患者的免疫系统极度低下，常难以承受放疗和化疗等直接杀伤肿瘤细胞的治疗手段，且患者体内存在多种免疫逃脱机制。作为细胞免疫重要的介导细胞，T细胞在机体对抗外来抗原与病原体入侵过程中发挥着重要作用。
肿瘤的免疫治疗包括免疫检查点阻断、肿瘤疫苗、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)、嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells, CAR-T)和T细胞受体嵌合型T细胞(T cell receptor-modified T cell, TCR-T)，为肿瘤的临床治疗开辟了前所未有的前景，但其临床效果仍然高度可变并具有患者特异性，部分原因是因为所有的免疫治疗方案极其依赖于内源和(或)过继性效应T细胞(包括CAR-T和TCR-T)能否有效地进入肿瘤靶组织，T淋巴细胞归巢缺陷可能是导致免疫治疗无效的主要原因之一。
一、T细胞免疫与胃癌
根据细胞表面是否表达CD4和CD8，T细胞可分为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。CD4+ T细胞又称为辅助性T细胞(T helper cells，Th)，根据功能与细胞因子分泌情况，可分为Th1、Th2、Th17、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)和滤泡状Th细胞(T follicular helper cells, Tfh)，它们之间存在着重要的平衡关系。因CD8+ T细胞具有细胞毒杀伤功能，通常又称为细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)。正常情况下，机体内CD4+ T细胞和CD8+ T淋巴细胞保持一定比例，以维持机体免疫内环境的平衡状态。如果人体内的T淋巴细胞总数或其亚群比例存在异常，则提示机体免疫功能紊乱，可能导致肿瘤的发生。
1.Th1和Th2细胞：
Th1细胞主要通过分泌白细胞介素(interleukin, IL)-2、重组人干扰素(interferon, IFN)-γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等介导细胞免疫，使CTL增殖，增强自然杀伤细胞(natural killer cells, NK)的细胞毒性。Th2细胞主要通过分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等介导体液免疫，辅助B细胞增殖分化并抑制Th1细胞增殖。
Th1和Th2类细胞因子之间的平衡极其重要。如果体内Th1类细胞因子向Th2类细胞因子漂移，则提示身体可能进入免疫抑制状态，干扰机体的抗肿瘤免疫。张筱茵等研究证实，胃癌局部Th1和Th2类细胞因子之间的平衡被打破，出现向Th2类细胞因子漂移，提示胃癌局部呈免疫抑制状态。化疗使胃癌患者Th2类细胞因子的表达减弱，甚至有向Th1类细胞因子漂移的趋势。Th1和Th2类细胞因子之间的平衡也与胃癌患者的预后密切相关。对胃癌患者来说，根治手术加化疗后，复发转移的风险依旧很大。定期检测胃癌患者外周血Th1和Th2类细胞因子的表达和变化，观察和分析机体的免疫状态，可以为肿瘤的免疫治疗提供实验依据，预测疾病发展动向，及时治疗，延长患者的生存期。
2.Treg细胞和Th17细胞：
叉头状或翼状螺旋转录因子3(fork head or winged helix transcription, Foxp3)是Treg细胞的特征转录因子，主要在CD4+ CD25+ Treg细胞表达。Treg细胞是主动抑制病理和生理学免疫反应的CD4+ Foxp3+细胞，有助于维持免疫稳态。
Treg细胞通过接触依赖的方式抑制免疫应答，或通过释放IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)调节免疫平衡。Treg细胞通过分泌TGF-β帮助肿瘤细胞逃离宿主的免疫监视，促进肿瘤进展。在肿瘤微环境中，高水平的TGF-β可促进Treg细胞和Th17细胞的分化和扩增，Th17细胞通过增加IL-17分泌促进肿瘤进展。Treg细胞和Th17细胞之间的免疫失衡可能在胃癌的发生和进展中起重要作用。
Li等报道，正常人外周血中Treg细胞和Th17细胞的比例呈正相关，但在胃癌患者中无相关性，且胃癌患者比正常人、淋巴结转移胃癌患者比无淋巴结转移胃癌患者的Th17/Treg比值显著增高。随着疾病进展，Th17和Treg细胞在肿瘤微环境中逐渐累积，导致健康个体中存在的免疫平衡被破坏。Th17细胞的增加与TNM分期和淋巴结转移有关，晚期患者比早期患者、淋巴结转移患者比无淋巴结转移患者Th17细胞百分比显著升高。Su等的研究也表明，胃癌组织中Th17细胞增加，Th17细胞浸润可能与胃癌的发展相关。
二、耗竭性T细胞与胃癌
耗竭性T细胞是一群效应功能减弱、持续表达抑制性受体的T细胞，其主要特征为一系列抑制性受体表达增加和细胞因子分泌减少。耗竭性T细胞相关免疫负调控分子包括程序性细胞死亡因子1(programmed cell death-1, PD-1)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3(T cell Immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, TIM-3)、细胞毒T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3, LAG-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator, BTLA)、CD160、CD244等。当出现慢性感染或肿瘤时，长期抗原的刺激会导致T细胞表面抑制性受体PD-1、LAG-3、TIM-3和CD160等增加。
免疫调控点大多从受体-配体相互作用开始启动，应用相应抗体靶向免疫调控点可有效逆转耗竭性T细胞，解除对TILs的抑制，提高抗肿瘤免疫反应能力，达到肿瘤免疫治疗的目的。这些抗体不是直接针对肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体和配体。在一系列针对T细胞抑制性受体的单克隆抗体(检查点阻断剂)临床试验中，效果显著。
1.PD-1/程序性死亡分子配体1(programmed death ligand-1, PD-L1)：
PD-L1是T细胞上PD-1的配体，可引起T细胞凋亡，从而抑制T细胞驱动的抗肿瘤免疫。PD-1则通过与其配体PD-L1结合抑制T细胞活化增殖和分泌细胞因子，负性调控免疫应答，诱导T细胞的凋亡。研究表明，PD-1的表达与PD-L1和Foxp3的表达相关，与胃癌预后不良相关。PD-1/PD-L1途径可能是有效的胃癌治疗新靶点。
胃癌患者CD4+和CD8+T细胞上的PD-1和LAG-3表达上调，且可能与胃癌术后细胞介导的免疫受损有关。PD-L1在正常胃组织中不表达或仅低表达，在进展期胃癌组织和外周血中表达升高。PD-L1表达与胃癌的发生、发展有关，与胃癌大小、侵犯范围、淋巴结转移、远处转移以及患者预后均相关。
近年来，在肿瘤免疫治疗方面，免疫检查点抑制剂抗PD-1/PD-L1抗体表现出了良好的应用前景。抗PD-1抗体pembrolizumab治疗进展期胃癌的Ⅰb期临床试验(KEYNOTE-012)结果显示，pembrolizumab具有良好的抗肿瘤活性和可控的毒性。美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)2016年年会公布了抗PD-1抗体nivolumab治疗进展期胃癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验(CheckMate-032)结果，客观缓解率与PD-L1表达相关。抗PD-1/PD-L1单克隆抗体治疗肿瘤，除了功效显著外，毒性低也是其一大特点。免疫相关不良事件在临床上表现为自身免疫样/炎症性副作用，其对正常器官系统和组织造成附带损害，包括皮肤、胃肠、肝、肺、黏膜和内分泌系统。
有研究表明，一些印戒细胞癌患者中也有PD-1/PD-L1表达，但基于PD-1/PD-L1表达的临床病理特征或临床结果并未表现出明显差异。PD-1/PD-L1、EB病毒、TILs和微卫星不稳定状态可能是预测印戒细胞癌患者预后的生物标志物，在选择PD-L1治疗的可能受益患者时，应考虑这些组织学特征。
抗PD-1单药安全性可靠，但仍有待进一步大规模临床研究证实。另外，抗PD-1联合抗血管生成药物阿帕替尼用于晚期胃癌的临床研究(NCT03472365)正在进行中。
基因敲除技术被应用于T细胞表面的负性调节分子的敲除，从而逆转免疫耐受。Su等首次采用CRISPR-Cas9基因编辑体系敲除患者外周血T细胞免疫调控点PD-1分子，解决了活化T细胞伴随的免疫调控点PD-1上调而失能的问题。该研究团队已在美国临床试验数据库注册开展CRISPR-Cas9介导的PD-1基因敲除的CTL细胞治疗EBV阳性进展期恶性肿瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床研究。此项技术的应用对胃癌免疫治疗具有重大意义。
2.Tim-3：
Tim-3是一种共抑制受体，在产生IFN-g的T细胞、FoxP3+ Treg细胞和先天免疫细胞(巨噬细胞和树突状细胞)中表达，抑制它们与其配体的相互作用。Tim-3在肿瘤免疫耐受中起关键作用。
半乳糖凝集素9(galectin-9)具有免疫抑制功能，与免疫刺激分子高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)均为受体Tim-3的竞争性结合配体。一旦与其配体结合，Tim-3就会发挥刺激或抑制作用，这取决于配体、细胞类型、成熟状态和Tim-3的表达率。galectin-9能够和PD-L1一起，在肿瘤细胞与表达PD-1和Tim-3的适应性免疫应答细胞之间形成复杂的相互作用。Petersen等在美国癌症研究协会2016年年会上首次提出放疗和(或)化疗明显上调凋亡前和凋亡胃癌细胞PD-L1和galectin-9的表达。放疗或化疗除了细胞毒性作用之外，还能诱导免疫应答，发挥清除肿瘤的作用。这种治疗诱导的免疫原性肿瘤细胞死亡，使宿主的免疫系统募集到肿瘤中，识别和杀死肿瘤细胞，甚至可以延伸到尚未治疗的转移灶，这种现象称为远隔效应。
Cheng等报道，胃癌组织中CD4+和CD8+ T细胞的Tim-3表达明显高于胃炎组织;Tim-3在CD4+ T细胞的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤浸润深度和TNM分期等临床病理参数显著相关;Tim-3在CD8+ T细胞的表达的水平与肿瘤侵袭和TNM分期相关;此外，CD4+和CD8+ T细胞中Tim-3表达较低的患者中位生存时间高于Tim-3表达较高者;Tim-3表达和TNM分期是胃癌患者的独立预后因素。
Shen等的研究显示，预后较差的胃癌患者，其体内的Treg细胞和CD8+ T细胞Tim-3高表达。Lu等报道，PD-1+和Tim-3+ CD8+ T细胞数量增加与胃癌患者CD8+ T细胞功能受损密切相关，PD-1和Tim-3路径的双重阻断可以全面逆转肿瘤诱导的T细胞耗竭，成为有效的联合疗法。目前，针对Tim-3的临床前研究结果显示，Tim-3分子在肿瘤免疫耐受中起关键作用，但尚无相关药物的临床试验证实。
3.CTLA-4：
CTLA-4是Treg细胞和活化的T细胞表达的必需的负调节因子。在局部肿瘤环境中，当T细胞被激活时，CTLA-4可以早期调节免疫应答，抑制T细胞活化及其受体信号传导，促进细胞周期停滞。PD-1主要作用于T细胞活化的后期阶段，因此CTLA-4和PD-1/PD-L1的联合阻断有更强的抗肿瘤效应。
临床研究显示，CTLA-4中的种系杂合突变导致CTLA-4的单倍体不足，可引发具有不完全外显率的常染色体显性遗传调节综合征。Hayakawa等报道，24例具有杂合性CTLA-4突变症状者中有3例发展为胃癌，3例患者中有2例呈现与萎缩性胃炎和肠化生相关的多灶性腺癌。普通多变型免疫缺陷病患者有易患胃癌的倾向。
CTLA-4是临床测试的第一种免疫检查点受体，但开发的两种CTLA-4单克隆抗体ipilimumab和tremelimumab临床试验结果均不理想。NCT01585987试验结果显示，在标准一线化疗后，114例局部晚期胃或胃食管结合部癌的患者随机分为两组，分别接受ipilimumab或 支持治疗。ipilimumab组患者的中位无进展生存时间短于 支持治疗组，两组总生存时间差异无统计学意义。tremelimumab用于转移性食管癌和胃腺癌的二线治疗，其客观反应率仅为5%，然而通过CT和肿瘤标志物的评估，存在疾病控制临床获益。
4.LAG-3：
LAG-3(CD223)由LAG-3基因编码，在活化的人T细胞和NK细胞上表达。LAG-3与主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex class Ⅱ，MHCⅡ)类分子结合，和CD4具有高度的相似性，和CTLA-4功能类似，可能与二者信号转导途径中的一些交叉相关。
目前有4种LAG-3靶向治疗药物，其中有3种应用于肿瘤治疗，包括BMS-986016(美国百时美施贵宝公司)、LAG525(瑞士诺华公司)和MK-4280(德国默克公司)，但关于胃癌治疗的研究较少。一项nivolumab联合BMS-986016治疗晚期胃癌的临床研究(NCT02935634)正在招募受试者。
LAG-3与PD-1/PD-L1可能具有协同效应，调节T细胞功能，钝化抗肿瘤免疫反应，诱导更大程度的T细胞衰竭。虽然CTLA-4、PD-1和LAG-3都在T细胞活化期间表达负调节因子，但是LAG-3和PD-1的高水平双表达主要限于浸润性TIL。因此，LAG-3/PD-1组合免疫治疗可以比非特异性或自身抗原特异性免疫应答更好地促进肿瘤特异性反应，比CTLA-4阻断毒性更低。双重抗LAG-3和抗PD-1抗体治疗比单抗治疗有更好的预后。LAG-3和PD-1之间的强大协同作用可能是新型肿瘤治疗的基础。
可溶性淋巴细胞激活基因3(a soluble lymphocyte activation gene-3, sLAG-3)是血清中的Th1活性标志物，可能与LAG-3有不同的功能，可促进树突状细胞(dendritic cells，DCs)成熟并攻击肿瘤细胞。
三、结语
CD4+和CD8+ T淋巴细胞、Th1和Th2类细胞因子、Th17和Treg细胞比例的变化以及耗竭性T细胞相关负调节因子的表达，对胃癌患者总体免疫状态的监控具有前瞻性的评估作用，有助于肿瘤临床医师更好地预测疾病发展动向。其他抑制性受体，如CD244、CD160、CD200、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域、B7家族等同样在肿瘤T细胞免疫中发挥着重要的作用。
免疫调控点疗法是肿瘤免疫治疗的热点和希望。目前，胃癌的抗PD-1/PD-L1治疗研究取得了初步成果，KEYNOTE-012和CheckMate-032等大型临床研究均显示出良好的抗肿瘤活性和可控的毒性。而且，PD-1和CTLA-4的双重阻滞、双重抗LAG-3和抗PD-1抗体治疗，均显示了比单抗治疗更好的效果。但是，PD-1阻断治疗仍缺乏定义明确的生物学标志物用于规范疗效评价和选择适用人群。临床实践表明，微卫星不稳定型、PD-L1高表达、肿瘤突变负荷高、EBV感染阳性、肿瘤组织高TILs水平等因素可用于PD-1阻断治疗选择适用人群的参考。
使用基因敲除技术解决活化T细胞伴随的免疫调控点上调而耗竭的问题，值得临床深入研究。胃癌的癌症基因组图谱分型对免疫治疗的病例筛选有一定的指导意义，不同类型胃癌的转移、复发、预后及对免疫治疗的反应性存在差异。
胃癌等实体肿瘤的免疫治疗挑战与机遇并存。目前，胃癌疫苗治疗多为其他疗法的辅助治疗，TCR-T和CAR-T对胃癌等实体瘤的研究仍在初期阶段，胃癌的免疫治疗仍有很长的路要走。未来肿瘤治疗的发展方向将是不同免疫疗法的联合，胃癌的免疫治疗要建立与传统放、化疗、靶向治疗相联合的个体化免疫治疗模式。
文章来源:公众号 肿瘤科空间
